Dados do Trabalho

Título

ANALISE DE TECNICAS METODOLOGICAS PARA OTIMIZAÇAO DE ESTUDOS DE BIOLUMINESCENCIA IN VITRO

Resumo

Introdução: Estudos pré-clínicos envolvendo linhagens celulares humanas derivadas de tumores malignos, tanto in vitro como in vivo, são fundamentais ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra o câncer.
Objetivos: Avaliar o impacto de diferentes concentrações de Puromicina sobre a viabilidade celular das células da linhagem tumoral 5637 de carcinoma urotelial de bexiga humano, a fim de se definir a concentração antibiótica ideal para seleção celular e estudar o papel de três tipos de reagentes lipídicos na transfecção do vetor plasmidial de bioluminescência em células 5637 de carcinoma urotelial de bexiga humano, na tentativa de se estabelecer um método padrão de transfecção de plasmídeo.
Métodos: A etapa da construção da kill curve foi procedida com 30.000 células plaqueadas e submetidas a doses crescentes de Puromicina (0,5, 1, 2, 5 e 10 µg/ml), com subsequente análise de viabilidade pelo citômetro de fluxo MUSE® em 3 momentos: 12h, 24h e 36h após a introdução do antibiótico. Para os estudos de eficácia de transfecção do vetor plasmidial bioluminescente pGL4.21, foram testados 3 reagentes de transfecção, dois à base de nanopartículas lipídicas (FuGENE HD Tranfection Reagent e Lipofectamina 2000 Reagent), e um a base de polímeros sintéticos (Xfect). Os resultados de luminescência foram analisados em 24 e 48h após a transfecção pelo luminômetro IVIS® Spectrum, uma importante plataforma multimodal de imagem utilizada para leituras de luminescência em modelos in vivo e in vitro.
Resultados: Para as concentrações de 0,5 e 1 µg/ml verificou-se um racional esperado decréscimo de viabilidade celular, de forma que quanto maior foi o tempo de exposição ao agente agressor, maior foi o índice de morte celular. A utilização de FuGENE foi eficaz para a transfecção de pGL4.21 quando comparadas as concentrações pareadas de 1,5:1 x 2:1 nos tempos de 24h (p=0,05) e 48h (p=0,05). Em relação ao XFect, houve eficácia de transfecção quando comparadas as concentrações pareadas de 1,5:0,45 x 2,5:0,75 nos tempos de 24h (p=0,02) e 48h (p=0,03). A transfecção com Lipofectamina 2000 foi altamente tóxica promovendo a morte de todas as células e o insucesso de transfecção do vetor.
Conclusão: Para células 5637, a dose padrão para seleção de células transfectadas definida pela kill curve é de 0,5 µg/ml. O reagente de transfecção FuGENE mostrou superioridade aos demais métodos, comportando-se como método ideal para transfecção não viral do vetor bioluminescente pGL4.21.

Palavras Chave ( separado por ; )

Câncer de bexiga; Bioluminescência; Padronização

Área

Ciência Básica